分析辣椒素對(duì)P糖蛋白和細(xì)胞旁途經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)透過的作用論文

　　P-糖蛋白(P-gp)是限制藥物從血液循環(huán)進(jìn)入腦和從腸腔進(jìn)入上皮細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1]，故聯(lián)合使用P-gp抑制劑可以增加藥物經(jīng)腸道吸收。Hamilton等首次發(fā)現(xiàn)維拉帕米、環(huán)孢菌素A(CsA)能與化療藥物競爭性結(jié)合P-gp，逆轉(zhuǎn)大腸癌耐藥性(MDR)，但其心腎毒性及免疫抑制作用明顯，限制了臨床應(yīng)用。近年來，一些植物化學(xué)和本草綱目中的藥物，也發(fā)現(xiàn)具有抑制P-gp功能的作用，如本派丙烷和姜黃，與合成的抑制劑相比它們具有更低的毒性。我們經(jīng)常食用的辣椒中所含的主要成分辣椒素(CAP)也表現(xiàn)出對(duì)P-gp功能的抑制作用。體外結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辣椒素能夠抑制P-gp對(duì)地高辛的外排作用。由于眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是采用細(xì)胞研究獲得，由于細(xì)胞的一些形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的局限性，并且P-gp在腸道中的分布是不均勻的，因此采用細(xì)胞無法預(yù)測藥物對(duì)不同腸區(qū)段粘膜上P-gp的影響，所以我們采用Ussing chamber法分別研究了辣椒素對(duì)空腸、回腸和結(jié)腸粘膜上P-gp功能的影響，并用熒光素鈉(CF)作為細(xì)胞旁途徑藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方式的標(biāo)志物進(jìn)行檢測。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 試劑 辣椒素(批號(hào)：048K5058V)，Hepes(批號(hào)：016K54331)，Trizma base(批號(hào)：103K5411)，羅丹明123(批號(hào)：046K3688)、熒光素鈉(批號(hào)：047K0676)均購于Sigma-Aldrich公司(St. Louis，MO，USA)。甲醇和乙腈為HPLC級(jí)別，購買自德國莫克公司。

　　1.1.2 儀器 熒光分光光度儀(美國Waters公司，型號(hào)為474);P13110S 電子天平，德國 Sartorins 生產(chǎn);7 mlUssing chamber裝置(美國Harvard公司)。1.1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250±20 g，購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK 粵 2006-0015。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法符合南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定和要求。

　　1.2 方法

　　1.2.1 藥物溶液配制

　　1.2.1.1 Hepes-Tris 緩沖液的配制 取 Hepes 6 g 溶于800 ml蒸餾水中，使之完全溶解。通入混合氣體(95% O2，5% CO2)10 min后，加入1.8 ml KCl(3 mol·L-1)、1.8 mlCaCl2(1 mol·L- 1)、0.8 ml MgSO4(1 mol·L- 1)、8.18 gNaCl，完全溶解后用TrisRONGYE(1 mol· L-1)調(diào)節(jié)pH至7.4，再加入5 ml葡萄糖溶液(1 mol·L-1)，用蒸餾水稀釋至1000ml，混勻即得。

　　1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)溶液配制 分別將辣椒素與R123或CF溶解在pH 7.4的O2/CO2氣體飽和的Hepes-Tris緩沖液中，這種Hepes-Tris溶液每天制備，實(shí)驗(yàn)用辣椒素質(zhì)量濃度為60mg·L-1，R123或CF最終質(zhì)量濃度均為4mg·L-1。

　　1.2.2 體外Ussing chamber實(shí)驗(yàn) SD大鼠禁食16~18 h，3%戊巴比妥鈉(12 ml· kg-1)腹腔注射麻醉，延腹中線將腹部切開，取出空腸、回腸和結(jié)腸。分別用生理鹽水清洗干凈，置入冰浴的Hepes-Tris緩沖液中通混合氣(95% O2∶5% CO2)培養(yǎng)。剪取空腸適量，于冰浴板上迅速剝離漿膜側(cè)的漿膜層，將腸粘膜固定于擴(kuò)散池上，回腸及結(jié)腸的操作方法與空腸相同。在擴(kuò)散室加入7 mlR123或CF與CAP的混合液，接收室加入7 ml Hepes-Tris緩沖液(均預(yù)熱至37.5 ℃);37.5 ℃保溫，并通入混合氣體。分別于15、30、45、60、75、90和120 min在接收室取樣0.5 ml，并同時(shí)補(bǔ)充相同體積相同溫度的Hepes-Tris緩沖液。

　　1.2.3 定量方法的建立

　　1.2.3.1 R123和CF的測定方法學(xué)考察 R123的激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm，可在此波長下測定R123 的熒光強(qiáng)度，空白無干擾，其熒光圖譜如圖 1。R123 在(15.625~500)g· L- 1，熒光強(qiáng)度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=1.0435X-1.0989，R2=0.9982，Y為吸光度，X為濃度�；厥章屎腿諆�(nèi)精密度分別為98.9%和1.9%。CF的激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm，可在此波長下測定CF的熒光強(qiáng)度，空白無干擾，其熒光圖譜如圖2。CF在(7.8125~500)g·L-1，熒光強(qiáng)度對(duì)濃度進(jìn)行回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.639X+0.068，R2=0.999，Y為吸光度，X為濃度�；厥章屎腿諆�(nèi)精密度分別為97.8%和2.7%。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，各組中分泌方向累計(jì)透過率與吸收方向累計(jì)透過率的比較用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析;各組間不同方向，不同分組的Papp比較用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

　　2 結(jié)果

　　2.1 辣椒素對(duì)R123體外經(jīng)腸粘膜透過的影響考察辣椒素與R123對(duì)空腸、回腸和結(jié)腸粘膜透過吸收方向(M-S)和分泌方向(S-M)的經(jīng)時(shí)透過變化(圖3~5)。計(jì)算得到capsaicin組R123的M-S及S-M方向的表觀滲透系數(shù)Papp(×10-6cm· s-1)，與control組對(duì)比，表明R123對(duì)空腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過均受到辣椒素的影響。但對(duì)R123經(jīng)回腸和結(jié)腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過均未受到辣椒素的影響。

　　2.2 辣椒素對(duì)CF體外經(jīng)腸粘膜透過的影響考察辣椒素與CF同時(shí)進(jìn)行腸粘膜透過時(shí)，對(duì)CF經(jīng)空腸、回腸和結(jié)腸粘膜M-S方向和S-M方向透過的表觀滲透系數(shù)Papp影響見圖6。計(jì)算得到capsaicin組R123 和 CF 的 M-S 及 S-M 方向的表觀滲透系數(shù) Papp(×10-6cm· s-1)，與空白組對(duì)比，CF經(jīng)空腸粘膜吸收方向和分泌方向的透過均受到辣椒素的影響。然而，辣椒素對(duì)CF在經(jīng)回腸和結(jié)腸粘膜透過過程中并未出現(xiàn)影響。

　　3 討論

　　P-gp作為一種能量依賴性藥物外排泵，大部分位于腸細(xì)胞頂側(cè)膜，能將粘膜端的藥物泵出到腸腔，即如文中所述的分泌方向，從而降低藥物的吸收，這是導(dǎo)致人體藥物耐藥的重要原因。R123是P-gp經(jīng)典底物，因其具有熒光特性，檢測方便，現(xiàn)在國際上用于評(píng)價(jià)P-gp功能活性研究。有研究表明，P-gp及其相應(yīng)基因Mdr1在腸道內(nèi)的分布，其表達(dá)量沿腸腔從空腸到結(jié)腸逐漸升高，這與前期Ussing Chamber實(shí)驗(yàn)中證實(shí)R123在小腸中轉(zhuǎn)運(yùn)以分泌為主結(jié)果相符，因此選擇R123作為研究辣椒素對(duì)P-gp經(jīng)腸透過影響的指示藥物。CF與R123轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不同，通過細(xì)胞旁途徑透過腸粘膜，廣泛用作細(xì)胞旁途徑藥物轉(zhuǎn)運(yùn)方式標(biāo)志物應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中，具有可見光范圍的熒光。用CF作為對(duì)照，更能完善實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，輔證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前Ussing Chamber擴(kuò)散池法被認(rèn)為是研究底物透膜轉(zhuǎn)運(yùn)行為的標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)用Ussing Chamber模型獲得藥物的Papp與人口服吸收分?jǐn)?shù)之間存在良好相關(guān)性，具有模擬為腸道環(huán)境的特點(diǎn)，操作簡單，成本較低，易于推廣，作為生物藥劑學(xué)研究的'新方法，近年在國外應(yīng)用較多，特別為腸段的分段定位研究提供有效研究手段。

　　由于藥物吸收是從腸腔先透過至粘膜層的上皮細(xì)胞，而后再到固有層，固有層存在很多微血管和淋巴細(xì)胞，藥物在此能被吸收如血液循環(huán)，導(dǎo)致很小的一部分透過粘膜肌層。因此，需要分離除去腸粘膜上的肌層組織，這是Ussing Chamber實(shí)驗(yàn)法的難點(diǎn)及技術(shù)關(guān)鍵。在亞洲，辣椒是一種廣為使用的調(diào)味品，尤其在東南亞地區(qū)，辣椒素在食譜中占據(jù)很大比重，辣椒在血漿中含量可達(dá)到8~25 μmol/L。因此，體內(nèi)辣椒素可能通過影響腸道內(nèi)P-gp功能，而對(duì)同服的某些P-gp底物藥物(如環(huán)孢素等)在腸道內(nèi)透過吸收產(chǎn)生影響，尤其是對(duì)于治療窗較窄，易受P-gp外排嚴(yán)重影響的藥物。實(shí)驗(yàn)使用體外UssingChamber技術(shù)考察辣椒素對(duì)R123經(jīng)空腸、回腸和結(jié)腸粘膜吸收(M-S)方向和分泌(S-M)方向的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)空腸粘膜透過時(shí)，R123的M-S方向與空白組相比顯著增高，S-M方向顯著降低，表明R123經(jīng)空腸粘膜M-S方向和S-M方向的透過均受到辣椒素的影響，而回腸及結(jié)腸粘膜透過時(shí)，M-S組及S-M組表觀滲透系數(shù)Papp與空白組相比均沒有顯著性差異，說明辣椒素在空腸透過時(shí)抑制了P-gp的功能，改變了R123經(jīng)空腸粘膜的透過性。而辣椒素在回腸和結(jié)腸對(duì)R123 的透過沒有影響，這可能跟 P-gp 及其相應(yīng)基因Mdr1在腸道內(nèi)的分布表達(dá)量沿腸腔從空腸到結(jié)腸逐漸升高有關(guān)，因此對(duì)于空腸粘膜上的P-gp蛋白影響更劇烈，而對(duì)于回腸及結(jié)腸粘膜上的P-gp可能需要更高濃度的辣椒素才能夠發(fā)揮作用。同時(shí)，為了輔證旁細(xì)胞途徑是否影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，選用CF作為標(biāo)志物進(jìn)行檢測。經(jīng)空腸粘膜透過時(shí)，M-S組及S-M組分別與空白組相比，均具有顯著性差異;經(jīng)回腸和結(jié)腸粘膜透過與空白組相比沒有顯著性差異，提示辣椒素僅對(duì)空腸粘膜上旁細(xì)胞通路有影響，卻并沒有改變回腸和結(jié)腸腸粘膜上緊密連接的狀態(tài)。

　　有研究表明，P-gp表達(dá)量沿腸腔從空腸到結(jié)腸逐漸升高，而辣椒素僅在空腸中顯示出對(duì)R123透過的影響，暗示辣椒素可能是一種較弱的P-gp抑制劑。腸道中緊密連接也呈現(xiàn)相似的表達(dá)情況，辣椒素對(duì)于CF的透過增強(qiáng)作用同樣只存在于空腸，表明辣椒素對(duì)藥物吸收主要部位——空腸具有粘膜改善作用。因而，喜愛食用辣椒的患者在使用P-gp底物類藥物和經(jīng)旁細(xì)胞通道轉(zhuǎn)運(yùn)吸收藥物時(shí)，其體內(nèi)藥物吸收情況值得關(guān)注。有關(guān)辣椒素對(duì)腸粘膜上P-gp影響的體內(nèi)In situ大鼠實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。因此，辣椒素抑制P-gp功能從而影響P-gp底物R123經(jīng)腸粘膜透過的作用具有腸段差異性，對(duì)R123和CF的影響僅僅存在于空腸，而在回腸和結(jié)腸卻影響很小，這可能與P-gp和緊密連接在腸粘膜上的分布是從空腸到結(jié)腸逐漸變化的分布有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)意義上服藥要忌辛忌辣有矛盾。本實(shí)驗(yàn)思路能為后續(xù)研究ABC外排轉(zhuǎn)運(yùn)體提供指導(dǎo)，而且能為臨床用藥提供更可靠的理論依據(jù)。

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